Korzyści wynikające z zastosowania metod molekularnych in vitro

Prof. dr hab. n. med. Krzysztof Kowal

Poradnia Alergologiczna Uniwersytecki Szpital Kliniczny i Zakład Alergologii
i Immunologii Doświadczalnej UM
Białystok

 

Korzyści wynikające z zastosowania metod molekularnych in vitro

w diagnostyce IgE-zależnych chorób alergicznych


Benefits of application of in vitro molecular methods in the diagnosis of IgE-dependent allergic diseases

S u m m ar y
In vitro allergy diagnostics has been developing rapidly for several years. This mainly due to great progress that has been made in the field of allergen synthesis, isolation and characterization. Application of in vitro allergy diagnosis based on assessment of IgE reactivity to individual allergen components allows for better identification of the main allergenic source and demonstration of mechanisms involved in cross-reactivity. The method can help in better selection of candidates for allergen immunotherapy
____________

Ostatnie lata przyniosły szybki rozwój metody diagnostyki alergologicznej in vitro. Spowodowane jest to w dużej mierze postępem w dziedzinie syntezy, izolacji i charakteryzacji alergenów. Zastosowanie diagnostyki in vitro w oparciu o ocenę stężenia IgE wobec pojedynczych komponentów alergenowych pozwala na lepsza identyfikację głównych źródeł alergenowych i wykazanie mechanizmów reakcji krzyżowych. Metoda ta może być również pomocna w kwalifikacji chorych do immunoterapii alergenowej.
 
Choroby alergiczne zależne od immunoglobuliny E (IgE) takie jak alergiczny nieżyt nosa, zapalenia spojówek, astma alergiczna, alergie pokarmowe, alergie na jady owadów czy anafilaksja występują w krajach uprzemysłowionych u przeszło 20% osób z ogólnej populacji. Diagnostyka chorób, u podłoża których leży natychmiastowa reakcja nadwrażliwości, opiera się na wykazaniu powiązania pomiędzy występującymi objawami klinicznymi a obecnością alergenowo-swoistych IgE (sIgE). W celu wykazania obecności sIgE stosuje się metody in vivo i in vitro. W praktyce klinicznej najczęściej stosowaną metodą in vivo są testy skórne punktowe oraz rzadziej testy śródskórne. W wyniku indukowanej alergenem IgE-zależnej degranulacji komórek tucznych dochodzi do reakcji skórnej o typie bąbel i rumień.

Pomimo szeregu zalet metody in vivo charakteryzuje również szereg wad, a do głównych należą uzależnienie wyników od reaktywności skóry oraz od jakości ekstraktu stosowanego do testów.

Rozwijające się sposoby izolacji natywnych alergenów jak i możliwości syntetyzowania białek będących alergenami przy użyciu metod genetycznych stanowią nowe źródła substancji stosowanych w testach diagnostycznych. Jednakże, zastosowanie takich nowo uzyskanych materiałów do diagnostyki in vivo musi być poprzedzone wykonaniem szeregu badań pokazujących bezpieczeństwo ich stosowania u ludzi. Takie postępowanie znacznie wydłużyłoby możliwość wdrożenia do diagnostyki alergologicznej poszczególnych alergenów, których poznano już dzisiaj przeszło 3000, nie licząc ich poszczególnych odmian. Natomiast zastosowanie powyższych substancji w badaniach in vitro, które pozwalają na wykrycie obecności sIgE w surowicy badanych osób może odbywać się w zasadzie bez ograniczeń. Obecnie do wykrywania obecności sIgE w surowicy stosowane są przede wszystkim testy oparte na metodach immunoenzymatycznych, w których ekstrakt alergenowy/ alergen związany jest z fazą stałą. Obecne w surowicy przeciwciała rozpoznające dane białka wiążą się z nimi, a po usunięciu niezwiązanych elementów surowicy IgE rozpoznawane jest przy użyciu znakowanych przeciwciał. Po dokładnym wypłukaniu niezwiązanych przeciwciał i dodaniu odpowiedniego substratu intensywność reakcji barwnej jest oceniano kolorymetrycznie, a stężenie sIgE w badanej surowicy jest proporcjonalne do intensywności zabarwienia.

Ocena stężenia sIgE za pomocą testów immunoenzymatycznych w diagnostyce chorób alergicznych charakteryzują liczne korzyści:
 
  1. Nie stwarza ryzyka anafilaksji, szczególnie jeśli chodzi o diagnostykę reakcji anafilaktycznych na leki czy pokarmy.
  2. Może być wykonywana u chorych przyjmujących leki blokujące reakcję skórną takich jak leki przeciwhistaminowe czy przeciwpsychotyczne jak również w sytuacjach, gdy stosowane leki mogą zwiększyć ryzyko ciężkiej anafilaksji lub utrudnić postępowanie w przypadku wystąpienia anafilaksji (β-blokery i inhibitory enzymu konwertującego).
  3. Może być wykonywana u chorych z rozległymi zmianami skórnymi oraz wkrótce po przebytej reakcji anafilaktycznej, czy też po intensywnej ekspozycji skóry na promieniowanie UV czyli w sytuacjach gdy wykonanie testów skórnych nie umożliwia uzyskania wiarygodnych wyników.
  4. Pozwala na zastosowanie nowych ekstraktów alergenowych oraz pojedynczych białek, w tym białek rekombinowanych czy modyfikowanych.
  5. Umożliwia szybką ocenę uczulenia na duży zakres alergenów.

Dostępne testy pozwalają na ocenę sIgE wobec alergenów:
 
  • wziewnych
  • pokarmowych
  • lateksu
  • niektórych leków
  • jadów owadów błonkoskrzydłych

Kowal K.: Korzyści wynikające z zastosowania metod molekularnych in vitro w diagnostyce IgE-zależnych chorób alergicznych. Alergia, 2018, 1; 11-14

________________________________
cały tekst do pobrania poniżej